通常绝大多数聚酮化合物都是由PKS催化，如红霉素的母体大环内酯糖苷配基是6-脱氧红霉内酯B（6-dEB），由一个起始单元丙酰辅酶A和六个甲基丙二酰辅酶A延伸单元经六个缩合步骤缩合而成[25,29]。阿维菌素生物合成的起始单元是异丁酰辅酶A（来自缬氨酸）或2-甲基丁酰辅酶A（来自异亮氨酸），而延伸单元是七个丙二酰辅酶A（用于乙酸酯单元）和五个甲基丙二酰辅酶As（用于丙酸单位）[33]。以上两种抗生素都是由Ⅰ型PKS 催化，Ⅱ型PKS催化的多柔比星是由丙酰辅酶A为起始单元，九个丙二酰辅酶A 为延伸单元缩合而成的[34]。大多数Ⅲ型PKS催化的聚酮化合物是以丙二酰辅酶A作为起始单元和延伸单元[35]（见图1）。不同的聚酮化合物在结构上具有丰富的多样性，其中一个原因是合成过程中采用了不同的酰基辅酶A作为起始单元和延伸单元[36]。因此，作为聚酮合成前体的酰基辅酶A 的供给对于其生物合成是至关重要的。

1.2 聚酮类化合物生物合成的前体供应及优化

图1 三类PKS催化的代表性反应

聚酮化合物的生物合成过程中，酰基辅酶A是关键的前体物质，也是必要的延伸单元。其中，丙二酰辅酶A是重要的中心代谢产物，是微生物合成许多可药用的聚酮化合物以及包括生物燃料在内的脂肪酸衍生化合物的基本组成部分[37]。胞内产生的丙二酰辅酶A会被优先用于脂肪酸的合成而不是其他衍生物，这会导致胞内合成聚酮化合物等次级代谢产物的前体不足，从而限制聚酮化合物的生物合成[38-40]。因此，抑制脂肪酸的合成通路，有利于增加丙二酰辅酶A对聚酮类化合物合成的供给[41-44]。

随着合成生物学的发展，挑选合适的底盘宿主进行聚酮化合物等生物活性物质的异源合成已被普遍使用[45]。近年来，特别是酿酒酵母、大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌已被工程化改造以部分替代放线菌用于聚酮化合物的生物合成。然而，发达的菌株和工艺通常有生产率不足的困扰。通常，细胞内被严格调控的丙二酰辅酶A的可用性被认为是限制整体产品合成的决定性瓶颈。因此，为改善丙二酰辅酶A的利用率而进行的代谢工程改造对于设计高效的微生物细胞工厂以生产聚酮化合物至关重要[46]（见图2）。

在大多数有机体中，丙二酰辅酶A是由乙酰辅酶A 羧化酶催化的乙酰辅酶A 羧化作用专一性合成。增加乙酰辅酶A的供给对于改善丙二酰辅酶A用于聚酮化合物合成的可用性是非常关键的。通常，调整中心碳代谢以使乙酰辅酶A作为直接的丙二酰辅酶A前体分子增加可用性，对于丙二酰辅酶A 合成和所有丙二酰辅酶A 衍生的产品都是有益的。如通过部分消除丙酮酸的羧化作用将糖酵解的代谢流集中于乙酰辅酶A，有助于促进在谷氨酸棒杆菌中合成丙二酰辅酶A 依赖的去甲丁香色原酮（一种药用植物芦荟中的五肽）[47]。谷氨酸棒杆菌中解除对iolT1 的表达限制，可以改善葡萄糖的吸收，提高酰基辅酶A的代谢池，进而增加聚酮化合物和羟基苯甲酸的合成[48-49]。

酰基辅酶A不仅作为起始单元和延伸单元参与聚酮化合物的合成，同时，在翻译后修饰中，酰基辅酶A也是酰基化的主要供体，参与聚酮化合物合成通路的翻译后修饰调控前体的供应。丙酰辅酶A是红霉素合成的直接前体，在红霉素生物合成过程中，一方面，丙酰辅酶A的积累有益于红霉素生物合成，另一方面，丙酰辅酶A 作为丙酰化的供体，其积累也有利于丙酰化的发生，但赖氨酸丙酰化会抑制红霉素生物合成途径中重要酶的活动。研究显示，NAD+依赖性的去酰基化酶的超表达可以规避高酰基辅酶A浓度的抑制作用。在其他酰基辅酶A衍生天然产物的生物合成中也存在类似的赖氨酸酰基化机制，如丙二酰辅酶A来源的生物碱和丁酰辅酶A来源的生物酒精等[50]。此外，为了提高红霉素合成前体（丙酰辅酶A）的供应，研究显示，还可以通过敲除丙酰辅酶A 转移酶基因acuA 和过表达SACE_1780 来绕过由丙酰化引起的反馈抑制作用，并使红霉素的产量提高22%[51]。这些改造不仅改善了前体供应以提高红霉素的产量，同时也为合成生物学提供了有效的翻译后修饰代谢工程学策略（PTM-ME），以改善次级代谢产物（见图3）。

图2 不同微生物合成的丙二酰辅酶A衍生产物

1.3 聚酮类化合物合成代谢途径改造

对聚酮类化合物代谢途径的改造主要包括聚酮生物合成相关基因簇的工程化改造、调控网络改造及合成途径改造等。在基因工程改造方面，可以通过对目标产物生物合成代谢旁路的相关基因的精简、优化，从而减少底物的消耗，强化目标产物的生物合成，提高其产量。如在新型的链霉菌底盘细胞FR-008 中，通过选择合适的元件即可高效地表达聚酮化合物[52]。又如在纳他霉素的产生菌Streptomyces chattanoogensis L10 中通过敲除1.3Mb和0.7Mb 的非必需基因后得到的底盘细胞能明显提高聚酮天然产物的合成效率[53]。随着CRISPR 技术的发明和应用，基因工程操作更加便捷和精准，这也使得CRISPR 技术被越来越多的合成生物学研究人员所关注，并被大量用于链霉菌的基因工程改造[54]。链霉菌作为天然产物合成的底盘细胞具有酵母、大肠杆菌或其他微生物所不具有的诸多优点，CRISPR 等新技术的应用，更使这些优点得以充分发挥[55]。近年来，CRISPR-Cas9 作为“经典”的CRISPR 系统，被广泛用于链霉菌基因编辑。如通过CRISPR-Cas9 系统在基因组中插入启动子激活PKS、NRPS 等基因簇用以在多个链霉菌中合成新的产物[56]。在糖多孢红霉菌中，使用CRISPR-Cas9敲入启动子Pj-PkasO替换基因组上原生启动子用以激活红霉素的合成，能使得红霉素的产量提高58.3%[57-58]。随着CRISPR技术的广泛应用，越来越多的CRISPR 系统被开发出来用于链霉菌的代谢工程改造。Tong 等[59]开发了一套综合的CRISPR 工具包，其中包括CRISPR-Cas9 系统的多种变体，以及用于链霉菌的CRISPRi 和基于CRISPR 的编辑系 统（CRISPR-base editing systems， CRISPRBEST）。这些CRISPR 工具可用于生成随机大小的缺失文库，引入小插入或缺失，生成特定靶基因的框内缺失，可逆地抑制基因转录以及替代链霉菌基因组中的单碱基对等。此外，该工具包还包含基于Csy4 的多路复用选项，可在单个实验中引入多个编辑内容。通过使用该工具包，可以将链霉菌中失活靶基因的时间缩短到10 天以内，比其他可选方案要快得多。此外，Cobb 等[60]基于CRISPR-Cas 平台建立的pCRISPomyces 技术也能对多种链霉菌进行高效的基因编辑，快速获得20bp～30kb等长度不等的基因缺失。

文章来源：《现代制造技术与装备》 网址: http://www.xdzzjsyzb.cn/qikandaodu/2021/0708/936.html