聚酮生物合成相关基因簇的工程化改造中，大片段的克隆一直是一个难点。然而，大多数聚酮合酶的基因簇约为70～80kb，如何克隆这些大片段是对其进行工程化改造，特别是异源表达的关键。最近，Liang 等[61]结合CRISPR-Cas12a 剪切和细菌人工 染 色 体（bacterial artificial chromosome，BAC）文库构建的优势开发了一种简单、快速和高效的基因簇克隆方法（CAT-FISHING），即CRISPRCas12a 介导的快速直接生物合成基因簇克隆，可以直接克隆49～139kb 的基因簇。经过进一步优化后，该方法能够在链霉菌底盘中以较低的时间成本有效地克隆并表达87kb 长、富含GC（76%）的生物合成基因簇。

图3 酰基辅酶A前体供应与酰基化供体对酰基辅酶A合成天然产物的功能相互作用［50］

聚酮化合物合成基因簇的表达，受到诸多调控因子的严谨控制，因此，对各类调控因子的改造也是众多研究人员关注的重点之一，同时也是聚酮化合物代谢网络改造的常见策略。微生物具有复杂精密的初级和次级代谢网络，这其中，各种调控因子发挥着四两拨千斤的作用，其受到修饰、改造及调控时，会直接或间接影响相关的代谢调控网络。这些调控因子有些能控制全局，有些只参与特定的专一途径的调控。因此，对这些调控因子进行改造或修饰，可以实现微生物次级代谢网络的精细化调控。如通过对Streptomyces albus J1074 中调控因子CRP 的过表达，及基因pfk 的缺失突变等操作，可以实现放线紫红素的异源表达[62]。微生物的营养吸收与利用对初级代谢和次级代谢都至关重要，不仅关系底盘细胞的生长，还是次级代谢前体物资的重要来源。在碳、氮、磷等营养素代谢过程中，有多重调控因子参与其中。如DasR 作为链霉菌中的多效调控因子，能在多种链霉菌中调控N-乙酰氨基糖、柠檬酸盐等的利用，从而影响链霉菌的初级及次级代谢[63-65]。氮代谢全局调控因子GlnR不仅调控链霉菌的氮源代谢，同时也参与碳源的代谢。如在糖多孢红霉菌中，GlnR 不仅调控作为聚酮合成前体的酰基辅酶A的代谢，同时也能调控作为红霉素发酵生产的底物淀粉的代谢[65-70]。链霉菌中磷源代谢受双组分调控因子PhoR-PhoP 的控制，同时还参与呼吸作用、细胞分化和抗生素的生物合成调控及与其他营养素的协同调控。在糖多孢红霉菌中，PhoP 在转录水平上可以通过直接和间接两种方式控制红霉素生物合成相关基因的转录，在翻译后修饰水平上，PhoP 的活性受到赖氨酸丙酰化调控[18,68,71]。在天蓝色链霉菌中，PhoP 抑制了几种分化和多效性调控基因，这影响了菌体生长并间接影响了抗生素的生物合成。在阿维链霉菌中也存在类似的调控机制[72-73]。此外，GlnR 和PhoP 也可以协同调控氮、磷的代谢，从而影响链霉菌次级代谢产物的合成[67-68]（见图4）。

图4 GlnR和PhoP介导的糖多孢红霉菌中初级代谢与红霉素生物合成之间的交叉调控

除了产物合成相关基因的工程化改造以及调控因子的改造外，通过对聚酮化合物的传统合成途径进行改造，以减少能源消耗，提高经济效率，是当前绿色生物制造的发展趋势。在传统的聚酮合成途径中，乙酰辅酶A是连接糖酵解、三羧酸循环和脂肪酸合成的主要代谢节点。当前大多数的聚酮化合物生产平台都依靠漫长的糖酵解步骤来提供乙酰辅酶A，这一过程需要消耗大量辅酶和ATP，同时天然受到复杂的调控影响。通过探索使用乙酸代谢提供乙酰辅酶A可以作为乙酰辅酶A供给的捷径，从而规避传统糖酵解途径的缺点，相关策略已应用在聚酮化合物三乙酸内酯（triacetic acid lactone,TAL）的合成中[74]。三乙酸内酯是聚酮合酶合成的典型副产物，同时也是很多聚酮化合物合成的前体[75]。目前，已经有诸多代谢工程研究人员用大肠杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母等建立了许多产TAL 的宿主菌株[74-78]。其中，Liu等[74]通过改造解脂耶氏酵母中乙酸盐的吸收途径，用于高效生产TAL，同时便捷获得乙酰辅酶A用于聚酮化合物的高效、经济性的生物合成。通过此乙酰辅酶A代谢捷径的碳通量超过了天然糖酵解途径提供的碳通量。与葡萄糖相比，这种替代性碳源具有代谢优势，可释放内源性代谢途径的限制从而提高碳的转化效率和降低成本效益（见图5）。

在自然界中发现的聚酮类化合物是在聚酮合成酶（PKSs） 催化下，通过克莱森缩合反应（Claisen condensation）进行迭代脱羧合成的骨架。这一传统的代谢途径依赖于PKSs 的催化。然而，PKSs 存在复杂的结构、能源效率低下、复杂的调控以及与延伸单位丙二酰辅酶A 的必要代谢途径的竞争等缺点，这些因素会限制聚酮类生物合成的通量。Tan 等[79]在传统的PKS 催化途径之外，开发了一条新的依赖聚酮酰辅酶A 硫醚酶（PKTs）的代谢途径来催化聚酮类主链的形成，这一过程通过迭代非脱羧克莱森缩合反应来实现，因此提供了一种综合和高效的PKSs 替代方案（见图6）。并已实际用于具有代表性的内酯、烷基间苯二酚酸、烷基间苯二酚、羟基苯甲酸和烷基酚聚酮族的聚酮骨架的合成。PKT 催化的反应提供了一种聚酮合成的新途径，这一途径利用硫醚酶的简单结构来实现更高的ATP 效率，并减少与基本代谢途径的竞争，所有这些都规避了PKSs 合成聚酮产物的低效率等缺点。

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